碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 是由Go来自spodarowiz等1于1974年在迅停控严斤牛脑垂体中发现的，因对3T3细胞有强烈的促增殖和有丝分裂作用，且等电点为9.6而得名。此次发现展开了对成纤维360百科细胞生长因子的鉴定，纯化及测序等研究的序幕。
- 中文名 碱性成纤维细胞生长因子
- 外文名 bFGFMAb
- 发现人 Gospodarowiz
- 发现时间 1974年
基本简介
用于抗肿瘤治疗的抗bFGF单克隆抗体还没有上市。但是很多公汽装的车责总测硫固执酸司却生产用于实验室研究的单抗来自。
早在1987年就有Massoglia等人首次制备了抗bFGF单抗，但他们制备的单抗无一对肿瘤生长有抑制作用360百科。bFGF在哺乳动物体内已发现轮围渐怀坏她右误构待视的23种FGFs[2]中被命名为FGF-2，与aFGF同属FGF-1亚家族。bFGF有18、22、22.5、24、34kd等5种亚型，低分子量 (18kd) bFGF定位于细胞质，而高分子量形式则定位于细胞核中[3]。bFGF在促进血管新生、细胞分裂及生长等方面有强烈的生物活性。bFGF分布极其广泛，高表达于一些恶性肿瘤，其与肿瘤病理分级、分期呈正相关，近来研究表明它成为了一些肿瘤的标志物，一直是研究热点[4]。对此针对bFGF的抗体研究引起了国内外学者极大的兴趣，bFGF抗体通过抑制bF案国装点坏叫百验GF活性及其下游信号传递，可产生明显的抗肿瘤效果。本文主要就bFGF (18kd) 单克隆抗体的制备、性质还料队季王台质展、应用、抑瘤机制、研究前景等进行综述。
bFGF单克隆抗体对于重组bFGF的表达、纯化和鉴定，体液中bFGF的定量检测和组织定位提供了有力的手段，为研究bFGF与肿瘤发生、发展机制的关系与开展对肿圆层缺龙立处倒李就瘤的诊断提供了重要基础;日益备受重视的bFGF全人基因工程抗体具有抗体药物的研究开发前景。
1 bFGF单克隆抗体
bFGF抗体的制备集中在20世纪80年代末到90年代，bFGF单克隆抗体研究则始于1987年，真稳美国加州大学Massoglia等[5]首次制备出4株bFGF单克隆抗体，之后日本Takeda公司[6]也制备了4株bFGF单抗并申报了专利因将知过怎场劳开仅(专利号United St英州决级宗联ates Patent 54呢边素78740、598119调且眼树冷烈含林7)，但无一抗体能抑制bFGF的促细胞生长活性。
1989年Reilly等[7]制备出4株bFGF单抗，其中DE6与aFGF有交叉反应，DG2是第一种具有体内外中和bFGF活性此朝春州法阿距的单抗。同年Matsuza服ki等[8]从192株杂交瘤细胞中筛选出2株分泌bFGF 单抗的细胞株，所分泌抗体分别被命名为bFM烧自沉故计育演快区氧-1和bFM-2，均能特异识别牛源性、人源性、鼠源性bFGF，与aFGF无交叉反应。体外实验发现上述两种单抗均能抑制牛血管内皮细胞 (BCE) 生长，在0.1-10ug/ml之间呈浓度依赖性，bFM-1作用强于bFM-2。1991年Akira Hori等[9]则首次报道中和性bFGF汉笔终早限景裂苦单抗 (3H3) 能在特定的条件下抑制体内bF赶氢请GF单独依赖型肿瘤的生长，不过所用的免疫原bFGF的第70和88位丝氨酸被半胱氨酸取代。1999年Anouma等[10]制备了3株举官挥存守训地bFGF单抗，发现2G11和1E6能体外中随李款企几钢来伯青给花和bFGF活性，并分析了肝素对单抗生物活性的影响，认识到识别受体结合位点的单抗具有体内外抑瘤活性。国内bFGF单克隆抗体研究始于1998年，向军俭等[11]制备的抗火二牛bFGF单抗能体外中和bFGF促3T3细胞增殖的活性，2008年又报道所制备的抗重组人bFGF的单克隆抗体能诱导黑色素瘤细胞B16凋亡[14]。以上报道的绝大多数bFGF单抗属于IgG1，IgM类的单抗报道较少[12]。
2 bFGF单克隆抗体的识别表位
抗体对其抗原表位的识别关系到抗体中和活性。成熟bFGF含有146个氨基酸，是由155个氨基酸的前肽脱去N端1-9氨基酸所形成[15]。人源性和牛源性bFGF仅有2个氨基酸的差别，其抗原表位研究一直吸引着人们。对抗体的研究表明，抗体活性与其识别bFGF的表位非常相关。Massoglia等[5]进行了抗体识别表位研究的首次尝试，他们制备的单抗McAbs 42识别缺少1-15肽段的bFGF分子;McAbs 6、8、38三种单抗的识别表位则位于完全抗原氨基端的10个残基内。Seno等[6]合成bFGF的N端1-9肽，同时用大肠杆菌表达重组bFGF (13-40) 肽段，通过肽段与bFGF分子的竞争实验，确定了Mab12和78识别位点位于1-9肽段内，Mab52和98的识别位点位于13-40肽段内。上述单抗都不能中和bFGF的体内外生物活性。Matsuzaki等[8]研究发现中和性单抗bFM-1不识别Tyr16bFGF (1-15) ，Tyr51bFGF (36-50) ，Tyr132bFGF (133-146) 这几个线性片段，说明bFM-1识别bFGF空间表位，而无中和性的bFM-2识别线性表位。另外，Anouma[11]发现识别bFGF肝素结合表位的单抗2G11体外能抑制肿瘤细胞生长但无体内抗肿瘤作用;而不与肝素竞争结合的单抗1E6却表现出非常强的体内外抗肿瘤作用。他们研究还表明具有体内抗肿瘤作用的bFM-1和3H3单抗与bFGF的结合都不受肝素的影响。这些结果显示识别bFGF受体结合表位的抗体能中和bFGF的生物学活性。目前，随着bFGF的线性序列、空间构象、受体 (FGFR) 以及结合肝素位点等的确定[16]，中和性单抗识别表位的研究可更进一步。图1所示为FGF-19中和性单抗的识别位点图[17]。蓝色和粉红色区域所示FGFR4，绿色和黄色区域表示两分子FGF-19，橘红色区域是FGF-19中和性单抗的识别位点。由于FGF/FGFR的结合方式一定，所以参考FGF-19单抗的研究可以确定FGF-2中和性单抗的识别表位。
3 bFGF单克隆抗体的应用
3.1 bFGF的定量检测
1989年Sato等[18]用bFGF多抗作为包被抗体，利用bFGF与肝素特异结合的性质，以酶标肝素为检测抗体，建立了第一个多抗-肝素bFGF夹心酶标检测法，最低检测量可到达3pg/100μl。1991年Watanabe等[19]建立了第一个实用性的bFGF单克隆抗体夹心法，方法中应用Mab52和Mab98两种单抗混合作为包被抗体，辣根过氧化物酶标记的3H3的Fab片段作为检测抗体，灵敏度可达10pg/ml，对血清的检测灵敏度可达30pg/ml。Masayuki等[20]改进了Watanabe的方法，通过改变酶反应底物使灵敏度提高了10倍，对血清的检测灵敏度达到3pg/ml。R&D systems公司即在此基础上开发出bFGF酶联检测试剂盒。Gabra等[21]又改进了Watanabe的方法，使用抗牛bFGF的两种单抗作为包被抗体，兔抗人bFGF多抗作为检测抗体，使得灵敏度可达1pg/100μl。这些方法的建立为bFGF微量检测提供了强有力的工具。国内向军俭等[22]建立的bFGF间接、竞争ELISA方法，灵敏度分别为10和1.0pg/孔。刘士德等[13]使用自制抗牛bFGF单抗建立的bFGF双抗体夹心法最低检测量达20μg/L，与商品化试剂盒(3pg/ml)差距比较大。
3.2 bFGF的定位标记
Takahashi等[23]使用鼠源性单抗Mab78对神经胶质瘤细胞和脑膜瘤分泌的bFGF进行免疫组化定位，发现bFGF大量分泌在这些肿瘤中。提示bFGF抗体可成为揭示bFGF与肿瘤相关性研究的有力工具之一，目前得到广泛应用。
3.3 bFGF生物学活性研究
Ernst等[24]在胃溃疡小鼠模型上发现，使用bFGF单抗能延缓溃疡的愈合，减少新生血管的数量，该发现进一步佐证了bFGF促血管新生的功能。Naoya Emoto等[25]发现针对合成短bFGF多肽氨基端 (1-24) 片段的抗血清能浓度依赖性的促进bFGF在小鼠甲状腺叶状细胞系FRTL-5的作用。Tao等[26]发现bFGF单抗能体内外抑制小神经胶质细胞的分裂。这些研究证明了 bFGF的促有丝分裂、促血管新生的生物学功能。提示bFGF抗体在研究bFGF生物学活性方面具有潜在价值。
3.4抑制肿瘤生长的研究
bFGF与肿瘤的密切相关性已有许多正面研究报道[4; 27]，大量有关bFGF抗体与肿瘤的研究业已证实。早在1989年就已发现bFGF单抗DG2能高度抑制体外培养的幼仓鼠肾脏内皮细胞对bFGF引起的血管新生应答[7]。Emoto等[28]也发现bFGF抗体能抑制肾癌细胞的生长。Nemati等[29]应用抗bFGF免疫疗法，发现bFGF抗体在无胸腺裸鼠模型中能抑制血管新生和恶性神经胶质瘤的生长。Takahashi JA[30], Gross JL[31], Stan AC[32]等也分别发现bFGF单抗能体内外抑制神经胶质瘤的生长。Murai等[33]还发现bFGF中和性单抗 (3H3) 能体内外诱导人脑胶质瘤细胞凋亡，为神经胶质瘤提供了一种有前途的治疗方法。但具体凋亡指数，凋亡机制有待进一步的研究。研究者发现bFGF和FGFR在胶质瘤细胞中高表达，而对照组的肺癌A431细胞却无表达[30]，大量研究显示与bFGF最为密切相关的是人脑神经胶质瘤。另外Ogasawara等[34]人分析了肝癌细胞bFGF和FGFR的分泌量，还发现单抗3H3能显著抑制肝癌细胞系及其体内移植瘤的生长，证明bFGF与肝癌的相关性。
随着研究的不断深入，学者们分析了不同肿瘤细胞的bFGF、FGFR表达量，bFGF抗体对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用、实体瘤抑制作用等，并观察了多种抗体联合使用时抑制肿瘤的协同作用。Brieger[35]等研究了bFGF抗体和抗血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growht Factor, VEGF)抗体对鳞状上皮癌细胞对辐射抗性的作用，发现抗bFGF和VEGF抗体能有效减少放射处理后细胞集落的形成，加入bFGF抗体可使鳞状上皮癌细胞防辐射作用降低20%。Coppola G[36]等制备出bFGF单抗DG2，采用三种注射方法给药，发现当给药方式为肿瘤内部注射时单抗能显著抑制小鼠软骨肉瘤的生长及血管新生，而静脉注射和腹腔注射则无上述作用。作者提出需对单抗体内动力学参数，有效给药方式等做进一步的研究。Rofstad等[37]研究了抗bFGF、VEGF、白介素-8(IL-8)和血小板衍化内皮细胞生长因子(Platelet-derived endothelial cell growth factor, PDGF)抗体对四株鼠移植黑色素瘤细胞系 (A-07、D-12、R-18和U-25) 的生长抑制作用，首次报道了bFGF抗体和PDGF抗体能抑制移植黑色素瘤的生长，血管形成和转移。提示bFGF抗体与其他生长因子的抗体存在协同作用。国内向军俭等[14]发现bFGF单抗能体外抑制小鼠黑色素瘤B16 细胞的增殖，并诱导其凋亡，机制有待进一步的研究。林卫等[38; 39]研究发现Santa Cruz商品化bFGF单抗能明显抑制卵巢癌细胞的增殖，卵巢癌的生长和血管新生，并呈浓度依赖性。谢庆祥等[40]通过建立裸鼠皮下移植膀胱癌动物模型进行研究，发现Sigma的bFGF单抗治疗组皮下瘤体积和重量比对照组均显著减少，瘤组织中增殖细胞核抗原(PCNA)指数和微血管密度(MVD)也显著降低，表明bFGF单抗对膀胱癌的生长具有明显抑制作用。其主要通过抑制膀胱癌细胞增殖和减少肿瘤血管形成而在荷瘤裸鼠体内发挥抗肿瘤作用。
以上研究结果表明包括鳞状上皮癌、人脑胶质瘤、软骨肉瘤、黑色素瘤、肾癌[7, 35]、肝癌、卵巢癌、膀胱癌等癌细胞都对bFGF抗体敏感，其增殖分别受到不同程度的抑制，其中胶质瘤U87和U251细胞系在bFGF抗体单独作用下还能发生凋亡，显示出bFGF与肿瘤的密切相关性，而且bFGF单抗有望成为肿瘤生物治疗的新方法。但国内目前尚未开发出具有显著体内抑瘤作用的bFGF单抗，随着bFGF及其抗体研究的进一步深入，将为一些疾病的预防和治疗提供新的途径和方向。
4 bFGF单克隆抗体抑制肿瘤生长的作用机制
各类研究显示，bFGF单抗抑瘤作用机制主要有两种:1、直接抑制高分泌bFGF/FGFR的肿瘤细胞生长[29; 30]，或诱导细胞凋亡[14; 33];对于少量分泌bFGF的肿瘤细胞作用比较小[34]。分泌bFM-1单抗的杂交瘤细胞注射到无胸腺的小鼠背部能致瘤，虽然小鼠血液中抗体活性很高，但无抑制实体瘤生长的作用，间接表明单抗对分泌bFGF的靶细胞起作用，而对bFGF分泌呈阴性的细胞无非特异细胞毒作用[8]，本室也发现类似现象。表明单抗对于受bFGF旁分泌和自分泌机制调控的肿瘤细胞才有效[30; 31]，对于bFGF内分泌型细胞无作用[41]。2、通过抑制bFGF诱导的血管新生从而间接地抑制肿瘤的生长[9; 31]。VEGF 单克隆抗体发挥作用不是针对血管内皮细胞本身，而是中和VEGF与其受体的结合[42]，bFGF与 VEGF同为膜分泌型生长因子，其机制是否类似于VEGF单抗?目前人们对bFGF的信号通路比较清楚，那么抗bFGF 中和性单抗抑瘤的分子机制究竟是阻断bFGF与其受体的结合起阻断和中和作用，是被内化入细胞直接起杀伤作用[43]，还是影响了FGFR受体酪氨酸激酶的活性引起下游信号通路发生改变，这些都需进一步的研究。其中可对bFGF/FGFR下游接头蛋白(Shb)和纤维细胞生长因子受体底物2(FRS2)，以及细胞外调节蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases, ERK) 和促分裂素原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPK) 的磷酸化水平的变化情况进行研究[17; 44]。
5 bFGF抗体药物研究展望
20多年来bFGF抗体经历了多克隆抗体、单克隆抗体、bFGF片段抗体、人源化抗体的发展阶段。目前bFGF单抗已成功商品化，中和性单抗有FB8 (Sigma公司)，bFM-1 (Millipore公司) 和3H3 (Calbiochem公司)。Santa cruz公司生产的许多抗体，是使用bFGF片段作为免疫原而制备的，同样具有广泛的应用功能。但是相比2004年被FDA批准上市的VEGF单克隆抗体Bevacizumab[45]来说，目前的商品化bFGF单抗却局限于实验室研究，其临床研究仍未见报道。原因可能有:1、bFGF只在某些恶性肿瘤中高表达、与某些肿瘤呈高相关性。因此针对bFGF高分泌型肿瘤时抗bFGF单抗的治疗才有效[9]，否则无效[46]，提示中和性抗体抑制血管新生和肿瘤生长的效果会因肿瘤的不同而出现较大差异，且肿瘤细胞需同时高表达bFGF及其受体，单抗才会有抑瘤作用;2、一些研究[47]表明bFGF单抗在阻断bFGF信号通路时，可致VEGF上调;另外bFGF与PDGF-BB也有协同作用[48]，阻断bFGF的信号通路时可激活PDGF-BB信号通路，从而不能抑制肿瘤生长。当然肿瘤受bFGF与其他多种细胞生长因子的网络调节较为复杂，它们促肿瘤生长作用的主次关系是bFGF单抗成为抗肿瘤药物的关键。
本文认为bFGF单抗的研究在以下方面仍值得完善:1、单抗识别表位的研究，最近报道的识别FGF-19和FGF-8b空间表位的单抗具有中和性与抗肿瘤功能[17; 44]，该研究为抗bFGF单抗的识别表位研究提供了新的方向;2、单抗引起的细胞信号通路变化，多种抗膜分泌型因子的单抗均能诱导细胞凋亡[33; 49; 50]，其机制的深入研究可能会给抗bFGF单抗的抗肿瘤研究带来新的思路;3、高亲和力bFGF单抗的制备及人源化研究[33]，该类研究可有效减少HAMA反应因而显得非常重要，目前本室正在开展此工作[51]。
bFGF单抗能在体内外有效地抑制自分泌或旁分泌bFGF依赖性肿瘤的生长，具有肿瘤生物治疗药物的开发前景[45]，进一步研究其抑瘤机制，以及其与多种肿瘤相关因子抗体的协同抑瘤作用，是bFGF单抗用于肿瘤治疗的研究策略之一[52; 53]。
